芍药苷如何合成？科学家找到关键“氧化工匠”

芍药是闻名遐迩的观赏花卉，而用芍药属植物的根加工而来的“白芍”和“赤芍”则是历史悠久的传统药材。现代药理学研究揭示，芍药药材中的特征性活性成分是芍药苷(Paeoniflorin)，具有多种生理活性。因此，探究芍药苷的合成路径，对于深入了解这种植物天然产物的代谢过程、实现植物天然产物合成的科学调控乃至人工合成，都有着重要意义。

　　芍药药材

　　但是，要厘清芍药苷的合成路径并不是一个简单的工作。这是因为芍药苷分子结构比较复杂：其核心骨架呈笼状立体结构，还需在笼状骨架的角碳上正确地引入多种修饰基团，才能最终合成出芍药苷。前期的研究表明，这个核心“笼子”是一种名为“α-蒎烯”的分子，但是它如何“被改造”的过程则尚不明晰。

　　芍药苷分子式

　　不过，上海辰山植物园的科研工作者打破了这一局面。近日，胡永红团队联合李建戌团队在国际期刊《Plant Physiology》上在线发表了题为Identification and catalytic optimization of pinene oxidases in paeoniflorin biosynthetic pathway的研究论文，锁定了对α-蒎烯进行改造的关键酶。同时还通过“定向改造”， 让它变得更高效，从而为未来绿色生物制造提供了新思路。

　　种质资源收集助力关键酶鉴定

　　从α-蒎烯到芍药苷，一个重要的修饰过程，就是给笼子状分子的角上加上氧原子，即氧化修饰。在细胞中，负责进行氧化修饰的一类重要酶，称为细胞色素P450(简称CYP)。但是，CYP是一个大家族，成员十分复杂，究竟是哪些CYP成员参与了芍药苷的氧化修饰呢?

　　辰山植物园丰富的芍药属植物种质收集就派上了用场。研究人员筛选了4个芍药苷累积部位和水平各不相同的牡丹、芍药品种，重点关注其中CYP家族基因表达和芍药苷累积的关系，从而筛选出多个和芍药苷合成密切相关的CYP成员。然后再借助酶活测定等实验，成功鉴定到3个全新的能够氧化修饰α-蒎烯的CYP成员。

　　牡丹与芍药植株以及细胞色素P450酶的功能验证

　　巧实验探明关键步骤

　　在鉴定到的3个CYP成员中，CYP76A225/226两个成员，能在α-蒎烯的10号碳上进行氧化修饰，形成羟基。而一个名为CYP71AN126的成员不但能在α-蒎烯“笼子”的4号碳和10号碳上分别进行氧化修饰，并且还能将4号碳上的氧化产物马鞭草烯醇进一步氧化为马鞭草烯酮。

　　那么，究竟哪个碳位上的氧化修饰参与芍药苷合成途径呢?研究人员通过病毒诱导基因沉默技术等反向遗传学实验，让这三个CYP成员分别“停工”，然后观察芍药苷产量变化，结果发现只有4号碳发生氧化修饰后的产物才能进入后续芍药苷合成途径，而10号碳的氧化并不参与芍药苷的形成。因此，CYP71AN126正是芍药苷合成过程中的关键酶，而对α-蒎烯4号碳的氧化修饰则是芍药苷合成途径中的重要定向步骤。

　　芍药苷合成的预测途径

　　精准改造，提质增效

　　科研工作者们并没有止步于发现了关键酶，而是进行了更进一步的探索。由于CYP71AN126也能进行10号碳的氧化，这样会导致“副产物”的形成。于是科研团队深入研究了这个酶的蛋白质结构，并通过计算机模拟α-蒎烯和这个酶的结合位点。实验发现，位于这个酶第493位的亮氨酸起到了决定性作用。如果将这个亮氨酸人工改造为异亮氨酸，能在保留主产物生成能力的同时，将副产物降低75%以上;而如果改造为甘氨酸，则能彻底消除对10号碳的修饰能力。

　　除了减少“副产物”，对这一关键位点的改造还能改变它对“被加工物”的选择。天然CYP71AN126能氧化修饰的不仅有α-蒎烯，还有α-蒎烯、马鞭草烯醇、环氧蒎烷和龙脑等，特别是将龙脑修饰加工成樟脑这一功能是首次在植物CYP中发现。而改造过的CYP71AN126则十分“专一”。这些都说明对这个关键位点的人工改造既能够控制“修饰哪种物质”，也能控制“修饰哪个位点”。

　　关键氨基酸在调控催化位点特异性及底物特异性方面发挥关键作用

　　明其理，利其器

　　这项研究不仅阐明了芍药苷生物合成中的关键氧化步骤，更是让人们获得了可定向改造的基因资源和酶工具。一个细胞就好似一个源源不断合成物质的工厂，当我们能够明确哪个酶在哪个合成过程中起到什么作用后，我们就可以通过对这些酶进行精确的改造，设计相应的“生产线”，或提升效率、或调节功能，让这个工厂能够生产出更加符合人类需求的物质，甚至实现人工合成。而这就是合成生物学的思路及手段。在未来，人们有望通过改造过的植物细胞工厂甚至微生物来生产芍药苷，从而提升产量，还能减少对野生药用植物资源的依赖。

　　本研究由上海辰山植物园、上海市资源植物功能基因组学重点实验室和中国科学院分子植物科学卓越创新中心联合完成。上海辰山植物园胡永红正高级工程师、于水燕副研究员和李建戌研究员为共同通讯作者，博士研究生谭希睿为第一作者，硕士生陈心然、博士生王隆基等也参与了该研究工作。陈晓亚院士、赵清研究员、裴天林副研究员和孔羽高级工程师、张颖高级工程师等在研究过程中给予了大量支持和帮助。该研究得到上海市中央引导地方科技创新项目、上海市科委农业科技项目、上海市农业农村委员会农业科技创新项目、国家自然科学基金项目以及上海市绿化和市容管理局科学技术项目等资助。

　　原文链接：https://doi.org/10.1093/plphys/kiag669